以连年时常报说念的“镉(Cd)米”、“镉麦”事件为例，说明现时我国所靠近的泥土欺侮问题不仅牵缠传统环境法限度环境欺侮与生态破损问题，何况更告成、更实验地反应出泥土欺侮导致食物安全事故形成的公众健康危害。当今【KONN-012】卑猥な匂い漂う黒ギャルAIKAの中出しグイ込みビキニ，国内学者对我国主要城郊蔬菜地的重金属欺侮近况进行走访研究，适度发现Cd欺侮的问题尤为凸起，其点位超标率达到7.0%，位于无机欺侮物第一位[1-2]。蔬菜Cd欺侮是食物欺侮物中较为严重的一类，Cd在蔬菜中富集积聚，通过食物链危害东说念主类健康和人命安全，而叶菜较其他种类蔬菜的欺侮进程更为严重[2-3]。
细胞自噬(简称“自噬”)是植物困境应答历程中一种最常见的自我保护机制。植物支吾外界环境压力时，如养分不及、缺氧、氧化应激、干旱、高盐、重金属及病原体感染等，自噬通路被激活产生细胞自噬体，用于看护细胞稳态与存活[4-6]。迄今为止，哺乳动物、酵母和植物中已果决杰出36个进化保守的自噬关系基因(Autophagy-related genes，ATGs)，永诀参与自噬带领、小泡成核、蔓延、熟习及与液泡交融等历程[7-8]。拟南芥中，ATGs缺失会导致养分穷乏、叶片早衰、寿命责难、细胞代谢组分更动、先天免疫激活和生物、非生物胁制耐受性受损等[9-14]。
Cd胁制属于非生物胁制。动物中，自噬关系基因顽抗Cd毁坏的功能研究比拟明晰[15-16]。Cd处置哺乳动物细胞后，可引起自噬美艳物LC3-Ⅱ (Microtubule-associated protein 1 light chain 3)抒发量加多，自噬溶酶体形成及ATGs上调，带领细胞发生自噬。然则，多数数别传明动物细胞产生自噬具有两面性：一方面看护细胞稳态，以终结细胞存活；另一方面过量执续的自噬会破损细胞器和迫切的卵白质，导致自噬性细胞升天，而该历程受到ATGs严实调控[17-20]。当今，植物中是否具有动物类似的调控机制仍不明晰。本研究以重金属Cd超富集蔬菜之一——芹菜(Apiumgraveolens L.)[21]为试材，禁受转录组测序(RNA-seq)行径筛选Cd胁制下芹菜自噬关系基因，并通事后续qRT-PCR实验考据自噬关系基因功能，旨在进一步酌量芹菜对Cd胁制的空隙机制。
1 材料与行径 1.1 材料培养及考研联想供试材料为芹菜品种‘皇后’，购于法国Tezier公司。考研在江西农业大学园艺实验室完成，2017年4月下旬播撒于养分钵，待幼苗长至5–6 cm时，挑选长势一致的植株移栽于装有1 L霍格兰氏养分液的塑料桶中，pH 6.0，温度25 ℃，光照强度为200 μmol/(s·m2)，每桶6株。预培养2周后，外源添加CdCl2·2.5H2O至Cd2+处置终浓度，参照马兰等[22]报说念，永诀为2、4、8 mg/L，以不添加剧金属为对照组(Control check，CK)，近似3次，32 d后得益植株。
1.2 cDNA文库构建、库检及测序分析禁受Trizol Plant Extraction Kit (TaKaRa，日本)索要芹菜根系总RNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳和核酸卵白仪检测总RNA纯度、浓度及无缺性。
将带有Oligo (dT)的磁珠富集mRNA；加入破灭缓冲液(Fragmentation buffer)将mRNA进行当场打断；以mRNA为模板用六碱基当场引物(Random hexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA团员酶Ⅰ合成第二条cDNA链，欺骗AMPure XP磁珠纯化cDNA；纯化的双链cDNA再进行终局树立、加A尾并策划测序接头，然后用AMPure XP磁珠进行片断大小选择；临了通过PCR富集得到cDNA文库[23]。文库检测及格后，禁受Illumina HiSeq2500平台进行高通量测序，测序读长为PE100。得到的Raw data经数据过滤，将其中接头序列及低质料序列去除，得到高质料序列数据(Clean data)后，再使用Trinity软件拼装[24]。
禁受DESeq[25]进行各异抒发分析，用FDR (False discovery rate)行动各异抒发基因筛选的场合。在筛选历程中，将FDR < 0.01且FC (Fold change) ≥2行动筛选程序。对各异抒发基因进行GO (Gene ontology)瞩目，并用DAVIDv6.8[26]瞩目器具进一步对各异抒发基因分析[23]。同期将各异抒发基因在KEGG数据库(Kyoto encyclopedia of gene and genomes)中进行瞩目，其权贵性富集分析的P-value值缱绻和阈值同GO富集分析疏浚。
1.3 自噬关系基因筛选及荧光定量PCR (qRT-PCR)考据禁受DESeq行径筛选自噬关系基因，qRT-PCR时间禁受TransStart Top Green qPCR SuperMix (Transgen生物，中国)，内参基因为β-actin。反应所用引物见表 1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
PCR反应的体系为：2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL，模板0.4 μL，上、下流引物各0.4 μL，加灭菌蒸馏水至200 μL；PCR反应条目为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 5 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，45个轮回；72 ℃蔓延7 min。
1.4 数据分析在Excel使命表中禁受2–ΔΔCt法分析ATGs基因相对抒发水平[27]。每个样品缔造3个生物学近似，并缱绻近似数据的程序差。
2 适度与分析 2.1 Cd胁制对芹菜植株助长的影响本研究率先对考研材料进行了表型不雅察、纪录与分析，随Cd浓度升高，芹菜幼苗发达为褪绿萎缩、植株助长逐步、须根数目减少、产量下落等症状(图 1)，说明芹菜植株助长受到彰着抑遏。此外，2、4、8 mg/L处置组的茎叶鲜重、根鲜重较对照组永诀责难了15.29%、42.38%、66.49%和19.42%、50.49%、58.98%，且处置组间各异权贵(P < 0.05)，说明外源Cd添加产生了彰着的负面效应，高浓度Cd加剧对植株助长的抑遏后果，且与浓度间产生了量效关系(表 2)。
2.2 转录本数据质料评估通过对照样品与2、4、8 mg/L处置组样品的转录组测序，共得到83.78 Gb原始数据，万般品的数据量均达到6.21 Gb，GC含量平均值为43.09%，Q30碱基百分比在91.43%以上(表 3)，说明转录组测序质料较高。此外，原始读取(Raw reads)的平均数永诀为23 905 679、22 971 867、22 306 185、24 666 755。经过Denovo拼装后共得到64 914个Unigene，Unigene的N50为2 005个，拼装无缺性较高，其中长度在1 kb以上的Unigene有24 375个。将万般品过滤后的高质料数据(Clean reads)与拼装得到的Unigene库进行序列比对，对照组与2、4、8 mg/L样品中可用于后续分析的比对遵循(Mapped ratio)永诀占80.26%、80.23%、80.14%和79.32% (表 3)。
对Unigene进行功能瞩目，包括与NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、eggNOG及KEGG数据库的比对，共得到40 400条Unigene的瞩目适度(表 3)。其中，永诀比对到NR库的基因数是37 438，瞩目率为92.67%；Swiss-Prot库的基因数是26 328，瞩目率为65.17%；GO库的基因数是20 966，瞩目率为51.9%；COG库的基因数是15 869，瞩目率为39.28%；KOG库的基因数是25 238，瞩目率为62.47%；eggNOG库的基因数是36 753，瞩目率为90.97%；KEGG库的基因数是17 848，瞩目率为44.18%。使用KOBAS2.0[28]得到Unigene在KEGG中的KEGG Orthology适度，展望完Unigene的氨基酸序列之后使用HMMER软件[29]与Pfam数据库[30]比对，适度标明Pfam库的基因数是31 687，瞩目率达到78.43% (图 2)。以上适度说明测序序列拼装后果较理思，可用于下一步基因筛选。
2.3 各异抒发基因筛选及分析禁受DESeq行径筛选，对照组与Cd处置间以及不同浓度Cd处置组两两之间共得到7 253个各异基因，其中上调4 698个，下调2 555个。其中，对照组与Cd处置组间的各异抒发基因数目较大，且上调基因数杰出下调，说明Cd胁制对芹菜基因转录调控产生了影响；而处置组间各异基因的数目彰着减少，尤其是4 mg/L与8 mg/L组间，推断4 mg/L可能是芹菜顽抗Cd毁坏的浓度承受拐点(图 3A)。
从维恩图不错看出，对照组和2 mg/L组间有2 411个基因各异抒发，对照组和4 mg/L组间有1 999个，对照组和8 mg/L组间有2 356个基因各异抒发(筛选条目|log2.Fold_change.| > 1且q-value < 0.005)。对照组与Cd处置组共同的各异抒发基因为1 278个(图 3B)。
应用DAVID瞩目器具对96个筛选的共同组合各异抒发基因进行GO功能聚类分析，共分为3大类19组，其中生物历程占42.1%，以细胞历程及吐故纳新历程瞩目最多；细胞组分占36.8%，以细胞和细胞身分瞩目最多；分子功能占21.1%，以诱骗和催化活性瞩目最多(图 4)。
通过KEGG富集分析，对照组与2 mg/L处置组间有662个各异Unigene可分类至50个代谢通路；对照组与4 mg/L处置组间有554个各异Unigene可分类至50个代谢通路；对照组与8 mg/L处置组间有683个各异Unigene可分类至50个代谢通路；2 mg/L与4 mg/L处置组间有47个各异Unigene可分类至25个代谢通路；2 mg/L与8 mg/L处置组间有114个各异Unigene可分类至38个代谢通路；4 mg/L与8 mg/L处置组间有11个各异Unigene可分类至5个代谢通路。其中，瞩目数目从高到低规律为核糖体(Ribosome，136个)、内质网卵白加工(Protein processing in endoplasmic reticulum，63个)、碳代谢(Carbon metabolism，45个)、植物激素信号转导(Plant hormone signal transduction，42个)、苯丙醇生物合成(Phenylpropanoid biosynthesis，39个)、植物病原相互作用(Plant-pathogen interaction，33个)、氨基酸生物合成(Biosynthesis of amino acids，32个)等。
2.4 自噬关系基因的筛选及qRT-PCR考据为进一步确证转录组测序质料，筛选了8个与自噬形成密切关系的各异基因进行qRT-PCR考据分析。其中，ATG12 (c140253)、VPS30 (c146704)、VPS34 (c149570)先上调后下落，而ATG8a (c131646)、ATG8f (c144576)、ATG13 (c143897)、AMPK-1 (c149168)和AMPK-2(c156499)均为上调基因。从图 5可知，qRT-PCR考据适度与转录组测序适度相一致，说明转录组测序适度可靠，可用于下一步功能分析。
性爱图 3 研究近几年，植物的自噬研究相等活跃，从神态植物拟南芥到藻类、裸子植物和被子植物，包括票据叶植物和双子叶植物[31]。自噬庸碌存在于真核细胞中，闲居情况下细胞内自噬看护在较低水平，当碰到困境胁制时会被多数带领，这在酵母、动物和植物中已被说明[2， 32]。哺乳动物中，Cd带领的自噬可行动一种细胞存活机制保护细胞，也可行动一种升天机制导致细胞升天，该历程受自噬关系基因调控[33-34]，植物中是否具有类似调控机制，当今尚不明晰。
植物自噬波及了繁多人命行径，早期研究发现植物细胞在养分穷乏条目下不详激活自噬，降解细胞内物资补充给饥饿的细胞，以看护细胞稳态；此后在植物助长发育、免疫应答、叶片衰落及环境胁制应答等历程中也发现了细胞自噬[35-39]。拟南芥中，已果决杰出36个进化保守的ATGs永诀参与自噬带领、小泡成核、蔓延、熟习及与液泡交融等历程[18]，而非生物胁制是带领细胞自噬的迫切因素之一[2]。本研究中，芹菜植株在Cd胁制下助长逐步，须根减少，何况与Cd浓度有彰着的量效关系，说明Cd胁制能梗阻芹菜助长，该适度和赵慧等[40]的研究适度一致。另外，筛选的8个自噬关系基因中，ATG8a、ATG8f、ATG13、AMPK-1和AMPK-2抒发一直上调，而ATG12、VPS30、VPS34三个基因则是先上调后下落。其中，ATG13可与ATG1互作共同运转自噬历程，ATG13抒发上调正巧说明了自噬体可能随Cd浓度飞腾【KONN-012】卑猥な匂い漂う黒ギャルAIKAの中出しグイ込みビキニ数目不停扩大。陈树德等[41]研究昏黑、高盐、涝害、高关切干旱胁制处置下，草莓叶片的自噬关系基因抒发呈总体飞腾趋势。Zhou等[42]禁受Cu2+、Ni2+、Zn2+、Cd2+和Mn2+处置香烟幼苗，发现18个ATGs对不同重金属处置有共同反应机制，其中11个ATGs抒发水平精深上调。以上适度营救了本研究的不雅点，但文件未报说念有ATGs先上调后下落的气候，这可能是芹菜的迥殊性。然则，Cd胁制下ATG13上调可能引起的自噬体加多究竟对细胞起保护功能仍是毁坏功能仍然未知，但从4 mg/L与8 mg/L处置组间的各异抒发彰着减少推断，4 mg/L可能是芹菜顽抗Cd毒性的浓度拐点。
另外，ATG8是自噬体形成历程中弗成或缺的卵白，亦然自噬的特异性美艳卵白。研究标明，ATG8与磷脂酰酒精胺形成的复合体(ATG8-PE)伴跟着自噬系数历程，决定了自噬体大小。本研究中，ATG8a和ATG8f是芹菜ATG8两个不同的拷贝。随Cd浓度飞腾，ATG8a和ATG8f上调抒发可能加多了ATG8-PE复合体的数目，促进养分物资轮回欺骗，以此改善芹菜支吾Cd胁制的材干来看护植株的闲居助长。这与Kaufmann等[43]发现ATG8转录水平在细胞碰到饥饿胁制时上调；赵慧等[40]报说念在拟南芥中过抒发ATG8f基因，转基因植株对Cd胁制的敏锐性增强了，与李微微[44]发现AGT8a可权贵进步水稻、拟南芥对低氮胁制空隙的研究适度相等相似，均是植物支吾困境胁制时开启高效欺骗养分物资的一种自我保护机制。另外，AMPK是细胞能量感受器[45]，因此AMPK-1和AMPK-2抒发水平上调相通也可能是芹菜感受细胞能量和养分情景更动、参与看护细胞能量和养分稳态的发达。
再有，自噬关系卵白ATG12由ATG12编码，与ATG5诱骗形成的复合物影响自噬的形成历程[46]；而VPS30与VPS34、VPS15等卵白互作，VPS34又参与自噬肇端，VPS34基因一朝缺失将引起细胞自噬的中断[47]。本研究中，ATG12、VPS30和VPS34基因先上调后下落抒发，可能与自噬激活关系，也可能是芹菜植株顽抗Cd毒性的应激反应所致。8 mg/L Cd2+处置浓度可能杰出了芹菜植株耐受领域，甚至ATG基因(ATG12、VPS30和VPS34)的mRNA水平责难，这说明ATG在自噬和凋一火之间可能有诊治作用，认识是为了确保有用欺骗有限的能量来看护细胞毒性下的体内均衡，Kang等[33]的研究适度营救了本研究的不雅点。
4 论断随Cd浓度飞腾，芹菜出现助长逐步、叶色褪绿、产量下落等症状，并陪伴多个自噬关系基因抒发上调。自噬基因在自噬发生历程中施展迫切的调控功能，通过自噬体运转、合成及结构积聚等改善芹菜支吾Cd胁制材干。而8 mg/L浓度Cd2+可能超出芹菜耐受极限，甚至ATG12、VPS30和VPS34抒发呈现下落趋势。